התפתחות צמחים

בעובר צמחי לא רואים את כל הרקמות והאיברים של צמח בוגר אך בעובר של עכבר למשל יש לו כל מה שיש  לעכבר צעיר. מצד שני בעובר של צמח יש את כל הדגמים שיש לצמח בוגר- בזאלי-אפיקלי, רדיאלי ובילטראלי. ראינו כי דגמים אלה מופיעים בשלב מאוד מודם באמבריוגנזה. החלקות בארבידופסיס ושלבי ההתפתחות מאוד זהים בין שלבים שונים.

מה המנגנון המולקולרי שיוצר את הציר הבזאלי-אפיקלי בעובר הצמחי? איך ניתן לזהות שנים שמעורבים בתהליך זה ובכלל תהליכי אמבריוגנזה אחרים? האם הא-סימטריה הבזאלית-אפיקלית מגיע מהסביבה של הביצית (ovule) או שזו תכונה אינטרינזית של הביצית עצמה? איזה סיגנלים שומרים על הדגמים הנפרדים בין תאים בזאליים ואפיקליים?

רוב הגנים בצמחים זוהו ב-forward genetic screens . בגישת forward מתחילים במוטנטים למשל עם בעיות באמבריוגנזה ומשם מוצאים מה הגן שמוטנטי וגורם לכך וזה יכול לומר לנו מה תפקיד הגן. מצד שני גישת ה-forward לא אומרת מה מהות תוצר הגן עצמו. בשיטת revrse מתחילים עם רצף של גן ומנסים לחפש מה הפנוטיפ כשעושים לו מוטציה למשל עם שיתוקו עם siRNA. בשימוש בגישת forward עשו מוטגנזה של המוני זרעי ארבידופסיס- כיצד? כימיקלים כמו EMS, קרינה מייננת או הכנסות רנדומליות של מקטעי DNA. בצמחים ניתן ליצור צמחים טרנסגניים בקלות וניתן לקחת חתיכת T-DNA בגודל של כ-17Kb ומכניסים אותו לצמחים. בארבידופסיס יש 5 כרומוזומים ומנסים לעשות את ההכנסה כך שיש T-DNA אחד בלבד בכל צמח. מגדלים את הזרעים המוטנטיים כשהם מוטנטיים בגן מסוים באחד העותקים- הם הטרוזיגוטיים במצב (+/m) מבחינת גן מסוים. נותנים לצמח הטרוזיגוטי שכזה להפרות את עצמו ובדור הבא מחפשים פנוטיפ שאנו מחפשים- כמו למשל פרחים עם פגיעה באמבריוגנזה. מחפשים את אלו שהם הומוזיגוטיים למוטציה כי בדר"כ לאלה יהיה פנוטיפ. מכאן מנסים לזהות איזה גן הוא מוטנטי.  EMS בדר"כ נותן מוטציות נקודתיות, קרינה מייננת יוצרת החסרים גדולים וארגון מחדש ולקוי של כרומוזומים וה-T-DNA מפריע לגן אם הוא נכנס ב-ORF. ככל שעושים screening  ליותר צמחים יש יותר סיכוי למצוא מוטנט דרוש. מכאן מוצאים את הגן שהוא מוטנטי- ניתן לבצע mapping, אם הכנסנו T-DNA ניתן לעשות PCR תואם לרצף שלו ולמצוא לאיזה גן הוא נכנס. בשנים האחרונות יותר קל לעשות sequencing לגנום שלם של מוטנט.

הציר הבזאלי-אפיקלי מופיע מוקדם וכבר הביצית המופרית מראה פולריות כשלמעלה נמצא הגרעין ורוב הציטופלסמה ובתחתית הווקואולה. האם יש סיגנלים מהרקמה האימהית? ציר העובר מיושר עם ציר ה-ovule וזה מרמז על קיום סיגנלים מהרקמה האימהית. ייתכן כי יש חומרים שמונחים באופן א-סימטרי בתא הביצה ע"י הרקמה האימהית. כמו כן ייתכן כי הרקמה האימהית מפרישה חומרים שעוברים דיפוזיה ומשפיעים על העובר. ידוע כי בחיות יש יצירת ציר מסוים ע"י הנחת חומרים מסוימים בביצית באופן דיפרנציאלי כמו בדרוזופילה. הרעיון הנוסף הוא שאין קשר לרקמה האימהית אלא שיש פולריות אינטרינזית בביצית שהרי יש לביצית פולריות מסוימת גם לפני ההפרייה ואין צורך בסיגנלים מהאם.

יש מוטנט sin1 שמראה השפעה אימהית חזקה על התפתחות העובר. מצאו אותו אחרי מוטגנזה ב-EMS והוא גורם לפגיעה באיברי רבייה נקביים בצמח הבוגר. רואים שב-sin1 ה-Integuments בחלק החיצוני של הביצית לא מתוזמנים בגדילתם. במוטנט חלש של sin1 ה-ovule  נראה נורמלי אך העובר גדל לא נכון- יש פגיעה בדגמים המרכזיים. חוזק המוטציה והפנוטיפ תלוי איפה היא ממוקמת בגן. איך sin1 משפיע? עשו הכלאות בין sin1 ל-WT ובדקו את העוברים. כשהאם היא WT גם אם האב הוא sin1 הומוזיגוטי אז כל העוברים נורמליים. כשהאם היא sin1 והאב הוא WT העובר הוא גם הטרוזיגוטי אך כל העוברים פגועים. למרות שראינו שני סוגי עוברים עם אותו הרכב גנטי הם נראים שונים לחלוטין פנוטיפית. מה שמשפיע על התפתחות העובר במקרה של sin1 הוא מי האם- האם היא sin1 או WT. אם האם הטרוזיגוטית למוטציה ב-sin1 העובר יהיה בסדר כי המוטציה היא רצסיבית. כשהעובר הפגוע גדל הוא בעל פגיעות מורפולוגיות שונות- לפעמים חסר שורשים, לפעמים נראה מוזר וחסר חלק עליון ותחתון ולפעמים אין להם מבנה של שני פסיגים בנויים כראוי. גן sin1 כנראה קשור לשליטה אימהית על האמבריוגנזה. sin1 אולי יוצר חומר שמשפיע על העובר או שהוא מקודד ל-RNA או חלבון שמושם בביצית כשהיא מתפתחת. לא ברור כיום אך ידוע ש-sin1 הוא הומולוגי לגן Dicer בדרוזופילה או C.elegans והוא חשוב להתפתחותם. ב-C.elegans הראו שזה גן שמשפיע על תפקיד האם הזיגוטה. SIN1 ו-DCL1 הם שמות שונים של אותו הגן. Dicer הוא ריבונוקלאז שקשור ליצירת miRNAs. בצמחים יש כנראה שוני בפעילות miRNAs בצמחים ובע"ח- בצמחים הם כנראה תואמים ל-ORFs של mRNA בעוד שבבע"ח הם נצמדים ל-3'UTR. כמו כן יש בצמחים בדר"כ קומפלמנטציה מלאה והם גורמים לשבירה של ה-mRNA אך בבע"ח זה בדר"כ לא קומפלמנטציה מלאה וזה גורם לעיכוב התרגום. מה SIN1 עושה? אולי ה-miRNAs שנוצרים ע"י SIN1 חודרים לביצית ומבקרים ביטוי גנים. sin1, sus1 ו-caf הם שמות לאותו גן כי המוטנט נמצא בחיפוש של פנוטיפים שונים שנגרמים ע"י הפגיעה באותו הגן.